可視化完整活生物體內的生物分子和細胞過程是化學生物學的主要目標。然而，由于組織對光的散射，主要基于熒光發射的現有分子生物傳感器在這種情況下具有有限的用途。相比之下，超聲波可以輕松地以高時空分辨率對深部組織成像，但缺少將其對比度與特定生物分子(例如酶)的活性聯系起來所需的生物傳感器。

【科研摘要】

為了克服上述局限性，美國加州理工學院Mikhail G. Shapiro教授團隊引入了第一個可遺傳編碼的聲學生物傳感器，即響應蛋白酶活性而在超聲成像中“點亮”的分子。這些生物傳感器基于一類獨特的充氣蛋白質納米結構，稱為氣體囊泡(GVs)，作者將其設計為響應三種不同蛋白酶的活性而產生非線性超聲信號。證明了這些生物傳感器能夠在體外，改造的益生菌內部以及小鼠胃腸道體內成像。相關成果以題為“Acoustic biosensors for ultrasound imaging of enzyme activity”發表在7月《Nature Chemical Biology》雜志上。

【圖文探討】

假設可以設計出基于GV的生物傳感器，這些傳感器可以根據特定生物分子的活性動態改變其超聲對比度。這種可能性源自最近的發現，即GV的聲學特性可以在其組成蛋白的水平上得到修飾。特別是，位于GV表面(圖1)并提供結構增強作用的支架蛋白氣囊泡蛋白C(GvpC)可以在其氨基酸序列水平進行修飾，從而改變GV力學。

圖1：煙草蝕刻病毒(TEV)內肽酶的聲學生物傳感器。

1.設計TEV內肽酶的聲傳感器

為了檢測TEV的活性，作者設計了一個包含TEV識別基序ENLYFQ'G的GvpC變體(圖1b)，假設將GvpC切割成兩個較小的片段會導致GV殼變硬，從而使其屈曲并產生增強的非線性超聲對比度。確定了一種工程改造的GV變體，與活性TEV蛋白酶孵育后，其崩潰壓力中點降低了約70 kPa(圖 1c)。在GVSTEV上GvpC的TEV切割有望產生分子量分別約為9和14 kDa的N和C末端片段。確實，暴露于活性TEV后GVSTEV的凝膠電泳導致出現了兩個裂解的GvpC片段，并且完整的GvpC譜帶強度大大降低(圖1d)。此外，通過浮力純化GV從未結合片段的溶液中去除，導致N末端裂解片段的條帶強度降低，表明其在裂解后部分解離(圖1d)。與dTEV孵育后，未觀察到GvpC帶強度的顯著變化。透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示兩種條件下完整的GV具有相似的外觀，這證實蛋白酶切割不會影響下面的GV殼的結構(圖1e)。動態光散射(DLS)在與dTEV和活性TEV蛋白酶一起孵育后，工程GV的流體動力學直徑沒有顯著差異，這證實了GV仍然分散在溶液中(圖1f)。

通過超聲對其進行了成像。公開GVSTEV樣品對TEV蛋白酶產生了很強的非線性聲響應，在施加的438 kPa聲壓下，對比度噪聲比(CNR)增強了約7分貝(dB)(圖1g)。在暴露于dTEV的對照中，觀察到的非線性對比度明顯較低，而正如預期的那樣，兩個樣品均產生相似的線性散射。與GV殼的壓力相關力學一致，GVSTEV的微分非線性聲學響應在高于295kPa的壓力下變得明顯，并一直保持增加到556 kPa，這時GV開始坍塌(圖1h)

2. 設計鈣蛋白酶的聲學傳感器

在使用模型TEV蛋白酶驗證了基本聲學生物傳感器設計后，作者檢查了其對其他內肽酶的通用性。通過將源自α-血影蛋白的識別序列QQEVY’GMMPRD33插入到Ana GvpC中，作者設計了μ-鈣蛋白酶的聲學生物傳感器(圖2a)。在有或沒有鈣蛋白酶和Ca2+的緩沖液中進行的加壓吸收光譜使能夠確定鈣蛋白酶的GV傳感器(GVScalp)，顯示在存在酶及其離子活化劑的情況下靜水壓塌壓力降低了約50 kPa(圖2b)。

圖2：鈣激活鈣蛋白酶蛋白酶的聲學生物傳感器。

3. 建立蛋白酶ClpXP的聲音傳感器

除了內肽酶，參與細胞蛋白質信號傳導和體內平衡的另一類重要酶是過程性蛋白酶，其從其末端開始展開并降解完整的蛋白質。為了確定是否可以針對此類酶開發基于GV的生物傳感器，作者選擇了ClpXP，這是一種來自大腸桿菌的過程性蛋白水解復合物，包含解折疊酶ClpX和肽酶ClpP。ClpX識別并展開包含稱為degrons的特定末端肽序列的蛋白質底物。然后將未折疊的蛋白質送入ClpP，后者將它們降解為小肽片段。假設在GvpC的C末端添加一個degron將使ClpXP識別并降解該蛋白，同時保留完整的基礎GvpA外殼，從而使GV具有更大的機械柔韌性和非線性超聲對比(圖3a)。

圖3：ClpXP蛋白酶的聲學生物傳感器。

4. 構建細胞內聲學傳感器基因

在演示了聲學生物傳感器的體外性能后，作者努力證明它們可以對活細胞內部的酶活性作出反應。作為細胞宿主，選擇了大腸桿菌Nissle 1917菌株。該大腸桿菌的益生菌菌株可以在哺乳動物胃腸道中定殖，被廣泛用作微生物治療劑開發的基礎，使其成為細胞內生物傳感器的重要平臺。為了開發針對ClpXP(ASGClpXP)的細胞內聲學傳感器基因(ASG)，作者將ARG基因簇(ARGWT)中的WT gvpC與可降解GVSClpXP的修飾gvpC進行了交換(圖4a)。

接下來，為了檢查ASGClpXP以動態方式響應細胞內酶活性的能力，作者通過基因組敲除編碼ClpX和ClpP的基因，生成了一個Nissle細胞(ΔclpXP)，并創建了包含這兩個質粒的質粒基因(圖4a)。這能夠從外部控制ClpXP酶的活性。ΔclpXP Nissle細胞與可誘導的clpX-clpP(clpXP)質粒和ASGClpXP共轉化。用L-arabinose誘導后，這些細胞中ClpXP的產生導致靜水壓塌點中點降低約160 kPa(圖4b)。在超聲成像下，與未誘導該蛋白酶的細胞相比，具有誘導的ClpXP活性的細胞顯示出明顯更強的非線性對比度(+6.7 dB)(圖4c)，同時顯示出類似的B型信號。在高于950 kPa的聲壓下，可以檢測到非線性信號增強(圖4d)。這些實驗證明了ASGClpXP能夠充當細胞內聲學傳感器來監測可變酶活性的能力。

圖4：監測工程細胞中的細胞內蛋白酶活性和電路驅動的基因表達。

5. 體內細胞內ClpXP活性超聲成像

在建立體外聲學生物傳感器工程的基本原理并證明其在活細胞中的性能后，作者評估了傳感器構建體在體內生物學相關解剖位置內產生超聲對比的能力。由于胃腸道在動物體內的位置相對較深，并且在臨床診斷和胃腸道病理動物模型中使用超聲，并采取了適當的措施以程度地減少氣泡和固體物質的潛在干擾，因此胃腸道也是超聲成像的極佳目標。

為了證明聲學生物傳感器在小鼠胃腸道的體內環境中產生非線性超聲對比的能力，首先將表達ASGClpXP和ARGWT的WT Nissle細胞共注射到小鼠結腸中。沿管腔壁的細胞群，另一個位于管腔中心。將細胞通過直腸注射的瓊脂糖水凝膠引入結腸，以實現精確定位和控制組成。使用非線性超聲成像，可以清楚地將蛋白酶敏感ASG產生的獨特對比度可視化為襯在結腸周圍的明亮對比環(圖5a)。使用來自換能器的高壓脈沖，在GV聲塌陷之前和之后采集的超聲圖像進行比較，確認非線性對比度的亮環是來自表達ASGClpXP的細胞(圖5a)。在九只小鼠的獨立實驗中，該結果是一致的(圖5b)。

為了證明酶活性的體內成像，作者將表達ASGClpXP的ΔclpXP Nissle細胞引入小鼠結腸中，無論是否轉錄激活細胞內ClpXP(示意圖均顯示在圖6中)。如前所述，細胞被包含在瓊脂糖水凝膠中。與不表達ClpXP的細胞相比，誘導表達該酶的細胞顯示出增強的非線性對比(圖5c)。聲塌陷證實了聲生物傳感器是非線性信號的主要來源(圖5c)。該性能在七只小鼠和細胞的兩個空間排列中是一致的(圖5d)。這些結果證明了聲學生物傳感器在體內成像的背景下可視化酶活性的能力。

圖5：在小鼠胃腸道中表達ASG的細菌的超聲成像。

【陳述總結】

該結果建立了用超聲成像無創地觀察蛋白酶活性的范例。該研究有助于未來的大量研究，以將聲蛋白酶傳感器的應用范圍擴展到本研究所示的概念驗證演示之外。而在大腸桿菌中的實驗并且在小鼠胃腸道內建立了這種生物傳感器在相關生物學環境中產生超聲對比的關鍵能力，其他以應用程序為中心的優化將使這些構建物能夠用于解決基礎生物學和合成生物學中的特定問題。同時，存在很大的空間用于進一步優化和推廣聲學生物傳感器的設計。